15 Jahre sind vergangen, seitdem Selene und ihr Geliebter, der Mensch-Lykaner-Hybride Michael, den Vampirältesten Marcus in "Underworld Evolution" vernichtet haben. In dieser Zeit haben die Menschen die Existenz von Vampiren und Lykanern entdeckt und einen bedingungslosen Krieg gestartet, der beide Spezies auslöschen soll. Selene, die während des Genozids gefangen genommen wurde, erwacht nach mehr als einem Jahrzehnt und stellt zu ihrem Entsetzen fest, dass sie eine Gefangene in einem hermetisch versiegelten Labor von Antigen ist, einem mächtiger Biotech-Konzern, der sich der Entwicklung eines Impfstoffes verschrieben hat, mit dem man den Virus bekämpfen will, der Vampire und Lykaner erschaffen hat. Selene bricht es das Herz, als sie erfährt, dass Michael tot ist. Doch für Trauer bleibt ihr keine Zeit, denn noch größer ist der Schock der Entdeckung, dass sie eine Tochter - Eve (India Eisley) zur Welt gebracht hat, während sie kryokonserviert eingefroren war. Mit ihrem Kind begibt sich Selene auf die Suche nach Asyl und findet eine Welt vor, in der ihr einst so stolzes Volk beinahe völlig ausgelöscht ist und die wenigen Überlebenden sich in unterirdische Verstecke geflüchtet haben. Von den verbliebenen Clans verstoßen, kann Selene nur auf die Hilfe des jungen Vampirs David (Theo James) vertrauen, der sich ihrem blutigen Rachefeldzug gegen Antigen anschließt, wo sich dunkle Kräfte verschwören, sie und ihr Kind zu zerstören. Während ihre traditionellen Feinde, die Lykaner, wieder Oberhand bekommen, scheint auch Selene machtlos, als sie mit dem bislang gewaltigsten Gegenspieler in der Geschichte der Underworld konfrontiert wird - einem genetisch mutierten Über-Lykaner...